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双酶切时,是直接用pcr产物就可以,还是需要

1、回收PCR产物: 在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的 选择非常重要,尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。...

不可以。 首先,采用的是质粒模板; 其次,扩增得到的非单一条带,如果不纯化直接酶切,那么得到的将是带有相应酶切位点的几种片段,继续试验的话,菌落PCR鉴定时可能会出现几种不同大小的条带。 第三、PCR产物里面缓冲液并不是合适的酶切缓冲液...

不可以。 首先,采用的是质粒模板; 其次,扩增得到的非单一条带,如果不纯化直接酶切,那么得到的将是带有相应酶切位点的几种片段,继续试验的话,菌落PCR鉴定时可能会出现几种不同大小的条带。 第三、PCR产物里面缓冲液并不是合适的酶切缓冲液...

还是用你之前设计的酶切位点的相关引物,你是要做什么样的片段设计,就把相应的引物设计在片段的上下游,只有对应大小的条带,说明就是初步正确的,但是不能说名没有单核苷酸突变,所以最后还是要送公司测序。

1、你的实验目的是什么? 2、如果是克隆,连接T载体后不用酶切,直接转化菌落pcr检测有目的条带的话送样测序即可。 3、如果是做表达载体构建,pcr产物和质粒DNA酶切后与没有酶切的在同一块胶上电泳,如果两个酶切位点很近,几乎看不到被切下来的...

理论可以,但是会影响效率。你到底是先酶切还是直接用T载体连接呢?

你是不是要把双酶切后的质粒与载体连接,而无论是PCR还是载体都无法通过电泳判断是否酶切完全,所以不好进行连接呀?对于PCR产物一般会采取这样的策略,将产物首先连接到T载体上,然后再用设计好的双酶切,电泳回收切下的条带,这样就能确保得到。

在你PCR引物上正向和反向序列前各添加一个酶切位点(既然是双酶切那这两个酶应该不一样,同时注意移码的问题,且这两个酶切位点是你要用的载体上也存在的,而已扩增的目的片段里没有)。pcr后连T载体再酶切回收。同时用同样的酶对你的载体酶切并...

PCR产物是双链线性分子,不存在质粒的三种形态。双酶切后分子形态保持一致,更不会自连。不知道你跑胶的时候是否点了酶切之前的产物做对照,如果没有,可能是胶浓度的问题,导致条带看上去大小不一。

如果没有其他杂带就可以。单一条带的PCR产物,如果酶切后也只有一条带,就可以用产物回收试剂盒回收。但如果酶切后有杂带或多条带,就只能做胶回收。

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